Optimalizace pohodlných PCR strojů v reálném čase

Pokud je to fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase pro kvantifikaci viru a genotypizaci SNP, potřebujeme PCR stroj s nejvyšší možnou specificitou; Pokud se jedná o detekci patogenu a mRNA, potřebujeme PCR s vysokou citlivostí PCR , tak jak bychom měli optimalizovat tento PCR stroj?

Zde je seznam obsahu:

l Zlepšení účinnosti amplifikace stroje PCR

l Používání primerů strojů v reálném čase pro obecné PCR

Zlepšení účinnosti zesílení stroje PCR

Abychom zlepšili účinnost amplifikace stroje PCR , specificitu a citlivost, můžeme pro experiment optimalizovat fluorescenční stroj na fluorescenci v reálném čase prostřednictvím řady opatření. Prvním je výběr cílové sekvence.

1, Volba pohodlné cílové sekvence stroje v reálném čase v reálném čase vhodná délka mezi 50 až 150 bp. Kratší sekvence zabere méně času na syntetizující a mít kratší doby zesílení, takže je snížena možnost amplifikovat kontaminování DNA.

2, Při výběru cílové sekvence použijte vyhledávání BLAST k analýze cílové sekvence pro polymorfismy a chyby sekvenování a zabránění jim. Pokud jsou v cílové sekvenci duplicitní sekvence, sníží se citlivost na detekci tohoto PCR stroje a je třeba se také vyhnout.

3, Ovládejte obsah GC ≤ 60% v cílové sekvenci. Vysoký obsah GC, ovlivní denaturace cílové sekvence v tepelném cyklu, ale také snadno vytvoří tento PCR stroj nespecifické zesílení.

4, Vyvarujte se generování sekundární struktury. Cílové sekvence s reverzními opakujícími se sekvencemi se snadno vytvářejí sekundární strukturu, která ovlivňuje hybridizaci pohodlných primerů a sond strojů v reálném čase.

Kromě toho musíme také zajistit, aby kvalita šablony neovlivnila zesílení, výsledky pohodlného stroje PCR v reálném čase mají spolehlivost. Například poškozená DNA nelze adekvátně adekvátně adekvátně adekvátně adekvátně adekvátně adekvátně adekvátně nebo vůbec amplifikovat. Také přítomnost DNA polymerázy inhibujících činidla (DMSO atd.) A kontaminantů (SDS atd.) V šabloně může ovlivnit spolehlivost výsledků amplifikace stroje PCR.

Použití primerů stroje PCR v reálném čase pro obecné PCR

Získejte pohodlné primery v reálném čase stroje PCR , tuto metodu lze použít také pro běžnou PCR.

1, délka by měla být 18-30 bp, aby byla zajištěna specifičnost vazby.

2, teplota tání (hodnota TM) by měla být 55-60 ° C a hodnoty TM obou primerů by se měly lišit o 2-3 ° C.

3, každý primer by měl mít 1 až 3 guaniny nebo cytosiny na 3 'konci, což může pohodlně snížit nespecifické amplifikace během PCR stroje v reálném čase. Více než 3 se opěraje a způsobí 'posuvný efekt ' vedoucí k nesprávnému prodloužení.

4. Obsah GC v primerech by měl být kolem 50%, příliš vysoký obsah GC zvýší hodnotu TM.

5, primery stroje PCR by se měly vyhnout reverzní opakujícím se sekvencím, protože vytvoří sekundární strukturu, což ovlivňuje vazbu primeru na šabloně.

6, Pokud je to RT-PCR, musíte se také vyhnout navrhování primerů, které se váže na sekvence exonu, což povede k falešně pozitivním experimentálním výsledkům PCR stroje. Správný přístup by měl být navržen na dlouhém boku intronu nebo na krátkých intronech nebo napříč exon-exonovou křižovatkou.

7. Odsolení a čištění primerů.

Všimněte si, že někdy, když jste udělali všechny body, primery se nemusí zesílit, takže byste měli přepracovat primery.

Zaměření na rychlou detekci nukleových kyselin a rychlé detekci POCT, Bioteke nabízí druhy laboratorních nástrojů jako: sběr vzorkování virů, automatický extraktor nukleových kyselin, stroj PCR a dezinfekční přístroj. A také poskytuje mnoho druhů činidel a souprav.